Імуноферментний аналіз (ІФА)
Імуноферментний аналіз (ІФА)
Зміст
В даний час ІФА застосовується в наступних ситуаціях:
1) Пошук специфічних антитіл до будь-якого інфекційного заболеванію-
2) пошук антигенів яких-небудь захворювань (інфекційних, венерологічних) -
3) дослідження гормонального статусу пацієнта-
4) обстеження на онкомаркери-
5) обстеження на предмет наявності аутоімунних захворювань.
Переваги методу ІФА:
1) Висока специфічність і чутливість методу ІФА (більше 90%).
2) Можливість визначення захворювання і відстеження динаміки процесу, тобто порівнювання кількості антитіл у різних часових проміжках.
3) Доступність ІФА-діагностики в будь-якому медичному закладі.
Відносний недолік:
1) Виявлення імунної відповіді (антитіл), але не самого збудника.
Основні поняття
Перед тим, як прояснити суть методу ІФА, стисло розберемося в деяких поняттях.
Антитіла (або імуноглобуліни - Ig) - Специфічні білки, що виробляються B -
лімфоцитами (імунні клітини) у відповідь на потрапляння в організм якого-небудь інфекційного патогена (віруси, бактерії, гриби та ін). Виділяють імуноглобуліни А (IgA), імуноглобуліни Е (IgE), імуноглобуліни М (IgM), імуноглобуліни G (IgG), імуноглобуліни D (IgD). Відрізняються вони один від одного молекулярної формою і масою, періодом напіврозпаду, участю / неучастю в інфекційних процесах, термінами виявлення з моменту інфікування. Якщо розглянути молекулярну вагу, то найбільше він у IgM - це пентамер (950000 дальтон) на відміну від решти Ig (від 150 до 200 000 Так), завдяки чому IgM просто не можуть проходити через плацентарний бар'єр. Тому виявлення IgM у дитини 1 року життя завжди є ознакою наявності інфекції у плода. У сироватці крові основна маса імуноглобулінів представлена саме IgG (75-85%), а найнижча - IgE (0,003%). В інфекційному процесі безпосередню участь беруть тільки IgA, M, G. IgE є ознакою алергічних реакцій і захворювань, а IgD - можна виявити лише в тканини лімфовузлів і мигдаликів, грає роль у формуванні місцевого імунітету.
Класи імуноглобулінів
Антигени - Високомолекулярні речовини органічного походження, зокрема збудників інфекційних та інших захворювань, а також речовини різних змінених клітин, що утворюються при тієї чи іншої хвороби (аутоімунні захворювання, онкологія).
Імунний комплекс - Комплекс антиген-антитіло, що бере участь в імунній процесі.
На чому заснований метод ІФА.
Виділяють кілька різновидів ІФА (прямий, непрямий, метод блокування, конкурентний), однак на практиці найчастіше використовується гетерогенний твердофазний імунний аналіз або ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
Основу імуноферментного аналізу становить імунна реакція антигену і антитіла з утворенням імунного комплексу: антиген-антитіло, в результаті якого відбувається зміна ферментативної активності специфічних міток на поверхні антитіл.
Суть методу ІФА
Простою мовою цей процес можна розділити на кілька етапів:
1) На поверхні лунок планшета доктора, проводить обстеження, знаходиться очищений антиген певного збудника. При додаванні біологічного матеріалу (сироватки крові) пацієнта відбувається специфічна реакція між цим антигеном і шуканим антитілом (імуноглобуліном). Це з'єднання буде виступати «особливим антигеном» в наступному етапі.
2) На даному етапі йде утворення ІК (імунних комплексів) - реакція між «особливим антигеном» і кон'югатом (це імуноглобулін, мічений ферментом пероксидазою). Додається особливий хромоген. Результатом такої ферментативної реакції є утворення пофарбованого речовини в лунці планшета, інтенсивність забарвлення якого залежить від кількості містяться в матеріалі пацієнта імуноглобулінів (антитіл).
3) Далі відбувається оцінка результату: фотометрирование за допомогою багатоканального спектрофотометра, порівняння оптичної щільності досліджуваного матеріалу з оптичною щільністю контрольних проб, математична обробка результатів. Кількість антитіл у пацієнта безпосередньо залежить від висоти оптичної щільності даної лунки.
Зазвичай на практиці використовують 96 ямковий планшети.
При вимірюванні оптичної густини (ОГ) досліджуваної рідини підраховується кількість (або концентрація) антитіл в певній одиниці об'єму. Потім результат порівнюється з контрольним зразком.
Потрібно пам'ятати:для кожної тест-системи розробляються індивідуальні показники для обліку результатів, показники норми і патології (тобто «референтні значення»). Це потрібно враховувати при оцінці результатів кожного конкретного дослідження. Некоректно інтерпретувати результати одній лабораторії по «референтним значенням» іншій лабораторії. Також некоректно порівнювати результати різних лабораторій між собою.
При постановці реакцій ІФА має значення і таке поняття як авідність антитіл.
Авідність антитіл - Це міцність зв'язку антитіла з антигеном і ту кількість антигену, що знаходиться у взаємозв'язку з іммноглобулінамі (антитілами). Авідність має велике значення при оцінці передбачуваного терміну інфікування, що надзвичайно важливо при діагностиці первинного інфікування у вагітних.
Основа тесту на авідність антитіл складається з обробки імунного комплексу (антиген-антитіло) розчином сечовини з метою руйнування білка. Високоавідні зв'язку залишаються цілими, а низькоавідних руйнуються. Результат видається у вигляді індексу авідності, що виражається у відсотках (%).
Які захворювання виявляються за допомогою ІФА-діагностики?
1. Інфекційні захворювання
1.1 Вірусні гепатити А (IgM, G), В антигени -HBsAg, HBeAg, антитіла - IgM HBcorAg, Ig сумарні HBcorAg, IgG HBeAg), С (антитіла Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig M, G) та інші.
1.2 ВІЛ-інфекція (IgG)
1.3 Цитомегаловірусна інфекція (антитіла IgM, G)
1.4 Епштейн-Барр інфекція або мононклеоз (антитіла IgM, G до EA, VCA, NA білків вірусу)
1.5 Герпетические інфекції (антитіла IgM, G)
1.6 Токсоплазмоз (антитіла IgM, G)
1.7 Краснуха (IgM, G)
1.8 Кір (IgM, G), Бруцельоз (IgM, G), Псевдотуберкульоз (IgM, G), салмонеллезом (IgM, G), Шигеллез або дизентерія (IgM, G), Аспергиллез (IgM, G), Кліщовий енцефаліт, Бореліоз і багато інших.
1.9 Паразитози (лямбліоз, токсокароз, трихінельоз, опісторхоз, ехінококоз, альвеококкоз та інші), при яких виявляються IgG
1.10 ЗПСШ (захворювання, що передаються статевим шляхом) - Мікоплазмоз (IgM, G), Уреаплазмоз (IgM, G), Хламідіоз (IgA, M, G), Сифіліс (IgG)
1.11 Гелікобактерна інфекція (IgG)
2. Маркери аутоімунних захворювань і показники імунітету людини (загальний IgE, загальний IgG, загальний IgA, загальний IgM, загальний IgD, секреторний IgA, IgG 2, IgG4, ЦВК-циркулюючі імунні комплекси, IgA і IgG до гліадину та інші)
3. Онкологічсекіе маркери (ФНП - фактор некрозу пухлини, РЕА - раково-ембріональний антиген, ПСА - простатспецифічний антиген, ХГ - хоріонічний гонадотропін, СА 125, альвеомуцін і багато інших)
4. Репродуктивні нарушения (естрадіол, прогестерон, пролактин, тестостерон, АФП- альфафетопротеин, ФСГ - фолікулостимулюючий гормон та інші)
5. Захворювання щитовидної залози (вільні і пов'язані Т3, Т4, тиреоглобулін, тіреопероксідазе - ТПО, тиреотропний гормон - ТТГ).
Даний список представлений далеко не всіма захворюваннями, які діагностуються за допомогою імуноферментного аналізу.
Матеріал для ІФА аналізу і правила його забору
Найбільш поширений матеріал для реакції ІФА - це сироватка крові пацієнта, взята натщесерце. Матеріалом також можуть служити спинномозкова рідина, навколоплідні води, вміст склоподібного тіла, слиз цервікального каналу і уретри, мазки.
Підготовка пацієнтів до здачі матеріалу для ІФА
Кров забирається натщесерце. Перед здачею крові не потрібно приймати ніякі препарати. Специфічне лікування (антибактеріальну, противірусну, протипаразитарну та інше) треба припинити не менш, ніж за 2 тижні до дослідження.
Терміни виготовлення ІФА
Імуноферментний аналіз матеріалу проводиться швидко, протягом доби. Затримки можуть бути в різних лабораторіях через накопичення певної кількості сироваток.
Можливі результати ІФА-діагностики
При оцінці результатів на конкретні інфекції має значення клас виявлених антитіл і їх кількість. Від цього залежить не тільки питання етіології інфекції (є вона чи ні), а й передбачувана стадія захворювання (гостра, хронічна), а також наявність активної інфекції (гострої або загострення хронічної) на момент обстеження.
Які приблизні терміни появи антитіл (імуноглобулінів - Ig)?
Самими ранніми антитілами є IgM. Виявити їх можна через 1-3 тижні після можливого інфікування, що характеризує гостру фазу інфекційного процесу. Друга ситуація появи антитіл IgM - активація (або загострення) хронічного процесу. Антитіла IgM циркулюють в середньому близько 3х місяців, потім їх кількість поступово зникає. Однак у деяких пацієнтів слідові кількості IgM можуть виявлятися протягом 1-2х років з моменту інфікування.
Сучасні тест-системи володіють високою чутливістю, внаслідок чого зустрічаються неспецифічні хибнопозитивні результати (нерідко у вагітних). Тому у даної групи пацієнтів позитивні IgM потрібно перевіряти ще!
Антитіла IgA з'являються через 2-4 тижні після інфікування, але в кількості, достатній для виявлення - через місяць. Сироваткові IgA синтезуються плазматичними клітинами селезінки, лімфовузлів і слизових оболонок, Секреторні IgA концентруються на слизових оболонках для виконання своєї захисної функції - беруть участь у місцевому імунітеті.
З 4й тижні після інфікування починають з'являтися антитіла IgG. При більшості інфекцій титр їх поступово збільшується з максимумом в різні терміни (в середньому через 1,5-2 міс), далі титр залишається на невисокому рівні і вказує на імунітет. При деяких захворюваннях (мікоплазмоз, хламідіоз, трихомоніаз) рівень IgG не буває високим, знижується істотно через відсутність імунітету при даних інфекціях.
Варіанти виявлення антитіл різних класів:
- Ізольоване виявлення антитіл IgM припускає наявність первинного
інфікування.
- Одночасне виявлення в крові IgM і IgG характерно для первинного інфікування
в попередні 2-3 місяці, а також при загостренні хронічного захворювання. Отже, при вагітності наявність IgM не завжди є ознакою первинного інфікування.
- Виявлення ізольовано IgG може вказувати як на імунітет до даного захворювання,
так і на хронічну інфекцію. У другій ситуації має значення і кількість антитіл (титр), і зміна цього титру в динаміці. Зазвичай дослідження проводять з інтервалом в 2-4-6 тижнів.
- Виявлення IgA ізольовано або з IgM вказують на первинну інфекцію. При
появі IgA разом з IgG передбачається активація хронічної інфекції (в середньому 2 тижні від моменту загострення).
Визначення авідності антитіл IgG є прекрасним доповнюючим етапом діагностики первинної інфекції від давнього зараження, що має своє клінічне значення, насамперед, при оцінці ризику внутрішньоутробного зараження плода. Виявлення низькоавідних IgG вказує на первинну інфекцію і виявляються в середньому через 4-6 місяців після інфікування, рідше довше. Низькоавідних IgG вимагають інших лабораторних підтверджень первинного інфікування (IgM). Високоавідні антитіла є або ознакою хронічного захворювання і його загострення, або сформованого імунітету.
Особливості у дітей грудного віку:у дітей до року, а іноді й 1,5 років в крові циркулюють материнські IgG до різних інфекцій (тобто сталася їх проникнення через плаценти від матері до плоду в період внутрішньоутробного розвитку). Вона не є самі по собі ознакою наявності інфекції в сьогоденні. Якщо ж у такjм віці виявляються IgM (нагадаємо, що материнські IgM проникнути через плаценту не можуть), то це ознака внутрішньоутробного інфікування чи набутою після народження інфекції.
Кількісний ІФА-метод
Результат ІФА-діагностики (за допомогою імуноферментного аналізатора) видається в певних одиницях виміру:
- Оптична щільність (ОП) проби - концентрація специфічних антитіл в одиниці об'єму. Чим вище ОП проби, тим вище концентрація антитіл. У деяких результатах йдеться про коефіцієнт позитивності (КП) - це теж оптична щільність зразка.
- Одиниці концентрації антитіл (нанограмм / мілілітр або нг / мл).
- У вигляді титрів сироваток: 1:20, 1:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200 і так далі. Діагностичні титри (при яких ставиться діагноз саме хвороби, а не факт інфікування) для різних хвороб різні.
- У вигляді символів - «+», «-», «?» (+, ++, +++, ++++).
- У вигляді якісної оцінки за заданим критерієм (позитивно чи негативно).
Правильно оцінити кількість антитіл, варіант класового виявлення імуноглобулінів, а, отже, виставити стадію хвороби і необхідність лікування може тільки лікар.
Не можна забувати, що для будь тест-системи розробляються свої «референтні значення» (варіанти норми), при перевищенні яких і діагностується те чи інше захворювання (варіанти патології). Для різних тест-систем «референтні значення» різні.
Коректне порівнювання результатів ІФА, взятих у динаміці, можливо тільки в разі їх виготовлення в одній і тій же лабораторії.
Лікар інфекціоніст Бикова Н.І.
