ПЛР діагностика - аналіз на інфекції

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - високоточний метод молекулярно-генетичної діагностики, який дозволяє виявити у людини різні інфекційні і спадкові захворювання, як у гострій і хронічній стадії, так і задовго до того, як захворювання може себе проявити.

Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) в 1983 році розробив Кері Мюлліса (США), за що в 1993 році він удостоєний Нобелівської премії в галузі хімії.

ПЛР аналіз став для більшості інфекцій своєрідним «золотим стандартом». Більшість фахівців стикаються з ним практично щодня і не уявляють без нього постановку остаточного діагнозу. ПЛР нерідко стає єдиною реакцією для виявлення активних стадій захворювання в ті моменти, коли не спрацьовують інші бактеріологічні, вірусологічні, імунологічні методи діагностики.

Переваги ПЛР-діагностики в сучасній медицині:

• Безпосереднє виявлення присутності збудника (а саме, специфічної ділянки ДНК або РНК збудника) в досліджуваному зразку.
• Висока специфічність дозволяє визначати унікальна ділянка ДНК або РНК, характерний для конкретного збудника, що виключає можливість помилкових реакцій.
• Висока чутливість методу ПЛР дозволяє виявити навіть поодинокі клітини збудників (вірусів, бактерій). Чутливість ПЛР-аналізу становить 10-1000 клітин в досліджуваному зразку (наприклад, чутливість імунологічних і мікроскопічних тестів - всього 103-105 клітин).
• Розробка універсальної методики ПЛР для виявлення різних збудників. Об'єктом для дослідження методом ПЛР служить генетичний матеріал (ДНК, РНК) збудника. Методика дозволяє виявляти декілька збудників з однієї біологічної проби.
• Досить швидке отримання результату аналізу. Повне дослідження проводиться за 4-4,5 години, рідше - кілька довше.
• Можливість виявлення патогенів до виникнення симптомів захворювання (доклінічна діагностика) і після минулої хвороби (ретроспективна діагностика). Прикладом доклінічної діагностики буде обстеження в інкубаційний період (з моменту зараження до виникнення скарг хворого), а також латентна інфекція (коли симптомів немає зовсім, а є тільки лабораторні дані - ПЦР, наприклад). Одним з важливих моментів ПЛР-діагностики є проведення ПЛР в архівному матеріалі або біологічних залишках, що важливо для ідентифікації особи або батьківства.

В даний час ПЛР-діагностика піддається суттєвому розвитку. Відбувається вдосконалення самого методу, знову і знову з'являються нові різновиди ПЛР, на медичний ринок надходять нові тест-системи для даної реакції. Завдяки цьому вартість ПЛР-досліджень з кожним роком стає доступнішим для широкого кола пацієнтів.

На чому заснований метод ПЛР

Основою полімеразно-ланцюгової реакції є багаторазове подвоєння (ампліфікація) певної ділянки ДНК або РНК за допомогою ферментів у лабораторних умовах. У результаті утворюється то кількість ДНК або РНК, достатнє для візуального аналізу. У ході дослідження копіюється тільки ту ділянку, який підходить під задані умови, і тільки в ситуації присутності його в досліджуваній пробі.

Наприклад, матеріал для дослідження, в якому передбачається наявність фрагментів ДНК або РНК збудника (слина, кров, сеча, виділення зі статевих органів), поміщається в спеціальний реактор (ампліфікатор). Далі до нього додаються специфічні ферменти, які зв'язуються з ДНК або РНК патогена, і відбувається синтез її копії. Це копіювання йде в кілька етапів за типом «ланцюгової реакції», і в кінцевому підсумку з однієї копії генетичного матеріалу можуть утворитися сотні і тисячі копій. Потім іде аналіз і порівняння результату з наявною базою даних про будову різних збудників. Допомогою ПЛР можна не тільки виявити тип збудника, але і видати кількісний результат аналізу, тобто як багато збудників в організмі людини.

Метод ПЛР в даний час розширює коло можливостей проведених досліджень: введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК, і отримав широке поширення в медицині, наприклад, для встановлення батьківства, поява нових генів та інше.

Які інфекції можна виявити за допомогою ПЛР-діагностики

1) ВІЛ-інфекція (можна виявити вірус імунодефіциту людини ВІЛ-1)
2) Вірусні гепатити А, В, С, G (РНК-HAV, ДНК-HBV, РНК-HCV, РНК-HGV)
3) Інфекційний мононуклеоз (ДНК вірусу Епштейн-Барр -ВЕБ)
4) Цитомегаловірусна інфекція (ДНК-CMV)
5) Герпетична інфекція (ДНК- вірусу простого герпесу ВПГ 1 і 2 типу)
6) ІПСШ (інфекції, що передаються статевим шляхом) - уреаплазмоз, гарднерельоз, хламідіоз, мікоплазмоз, трихомоніаз,
7) Туберкульоз (мікобактерія туберкульозу)
8) Онкогенні віруси - папіломавірусна інфекція (вірус папіломи людини (в тому числі його онкогенні види 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58, і 59)
9) Бореліоз, кліщовий енцефаліт
10) Лістеріоз
11) Кандидоз (гриби роду Candida)
12) Гелікобактерна інфекція (Helicobacter pylori)
та інші

Враховуючи спектр збудників, ПЛР-діагностика активно використовується в гінекологічній, урологічній практиці, практиці інфекціоніста, в пульмонології, фтизіатрії, гастроентерології, гематології, онкології та інших.

Матеріал для дослідження і правила його забору

Матеріалом для ПЛР-дослідження, в якому можна виявити чужорідну ДНК бактерії або ДНК або РНК вірусу можуть служити різні біологічні середовища і рідини людини: слизу, сечі, крові, мокротинні, соскобе епітеліальних клітин, тканинах плаценти, крові, соку простати, навколоплідні води, плевральна рідина.

При обстеженні на інфекції, що передаються статевим шляхом (ІПСШ), у чоловіків і жінок забираються виділення зі статевих органів, мазок або зішкріб з шийки матки, мазок або зішкріб з уретри (сечівника), сеча.

При обстеженні на інфекції (герпетичні інфекції, ЦМВІ, мононуклеоз, токсоплазмоз, гепатити В, С, ВІЛ-інфекція) на ПЛР забирають кров.

Для діагностики інфекційного мононуклеозу, ЦМВІ, герпетичної інфекції забирається мазок із зіву, для обстеження на ЦМВІ - сеча. Нерідко для обстеження на ураження нервової системи при ряді досліджень забирається спинномозкова рідина.

У пульмонології матеріалом служить мокрота, плевральна рідина.

При обстеженні на внутрішньоутробні інфекції - навколоплідні води, тканини плаценти.

Підготовка до здачі матеріалу та проведення ПЛР-діагностики

Практично всі пацієнти, яким проводиться ПЛР-діагностика, вправі розраховувати на достовірний, точний і швидкий результат, залежний у великій мірі від можливості лабораторії, професіоналізму лікаря-лаборанта. Разом з тим, багато хто не замислюються, що ця сама достовірність багато в чому залежить і від нас самих, а саме від рекомендацій лікуючого доктора, способу життя і правильності забору матеріалу. При заборі матеріалу потрібні умови, що виключають контамінацію (забруднення) матеріалу і, відповідно, ставлять під сумнів об'єктивність аналізу.

Правильна підготовка до здачі матеріалу не представляє особливих складнощів. Існують наступні рекомендації лікарів для пацієнтів:

1) не жити статевим життям за добу до здачі матеріалу-
2) кров для дослідження здається вранці натщесерце (не їсти, не пити) -
3) при здачі сечі збирається перший ранкова порція в чистий стерильний контейнер.

Терміни готовності ПЛР-аналізу

Остаточний результат готовий через 1,5-2х доби після здачі матеріалу. У деяких випадках результат готовий в перший же день.

Розшифровка результатів ПЛР

Негативний результат ПЛР вказує на те, що в досліджуваному матеріалі на момент його здачі не виявлено ніяких слідів інфекційних агентів. Більшість випадків показує відсутність інфекції, яку намагалися знайти в досліджуваній пробі.

Позитивний результат ПЛР вказує на виявлення слідів інфекції в досліджуваній біологічної пробі. З великою точністю позитивний результат вказує на наявність інфекції в даний момент часу.

Існують ситуації, коли ПЛР виявляється позитивною, а про активну інфекції говорити не можна - це так зване «здорове носійство» без клінічних симптомів хвороби, яке не потребує лікування, але вимагає динамічного спостереження у лікаря. Спостерігається частіше при ряді вірусних інфекцій (ВПЛ, ЦМВІ, ВЕБ-інфекція, герпетична інфекція та інші) в таких матеріалах як слина, зішкріб цервікального каналу, уретри, тобто з місцевого вогнища. Однак не можна забувати, що передача інфекції від носіїв здоровим людям можлива, як і можливий перехід в хронічну форму хвороби з активацією процесу. Якщо ж ПЛР позитивна в крові, то це вже не носійство і потребує специфічного лікування.

Кількісний результат ПЛР оцінюється тільки лікарем індивідуально для тієї чи іншої інфекції окремо і не має спільних градацій. На підставі кількісного результату ПЛР лікар може встановити ступінь активності інфекції і виставити стадію хвороби, що безумовно відіб'ється на курсі і дозах призначених лікарських засобів.

Один з останніх хвилюючих питань: наскільки точна ПЛР-діагностика?

Для ПЛР аналізу існує 3 визначення:

1. Точність (з високою часткою ймовірності можливе виявлення або відсутність інфекції).
2. Специфічність (точність виявлення конкретної інфекції).
3. Чутливість (навіть при низькому вмісті генетичного матеріалу збудників в досліджуваному зразку інфекція буде виявлена).

Полімеразно-ланцюгова реакція практично не видає хибнопозитивних результатів (тобто не буває позитивних проб там, де інфекція відсутня). Хибнонегативні результати спостерігаються рідко (частіше це пов'язано з відсутністю активної інфекції у людини в даний момент). Наприклад, латентна інфекція, хронічна інфекція поза активності.

Лікар інфекціоніст Бикова Н.І.